生物样本库（biobank）是一种集中保存各种人类生物材料，用于疾病的临床治疗和生命科学研究的生物应用系统。人类生物材料包括生物大分子（DNA、RNA、蛋白质等）、细胞、组织和器官等样本。
 
近年来，生物样本库发展迅速，保存的人体样本多达几十种，而各个样本库并没有采用标准、统一的低温保存技术和方法，在长期的储存过程中，可能造成所需要的样本信息发生变化。所以，在探索低温保存机制的基础上，选择合适的低温保存剂、升降温速率等方法处理样本后，储存在合理的温度环境中，是保证生物样本长期保存质量的关键。
 
今天就一起来看看常见的几种样本存储的温度，以及如何选择适合自己样本的存储温度。希望对大家日常样本管理有所帮助。
 
 
一、储存温度对样本的影响

生物样本的长期储存，通常使用尽可能低的温度来降低样本内的生化反应，以提高样本内各种成分的稳定性。生物大分子、细胞、组织和器官的常用储存温度为 -80℃（超低温冰箱）、-140℃（液氮气相或深冷冰箱）及 -196℃（液氮液相），温度越低样本的稳定保存时间越长。

 

不同温度对生物样本的影响和保护作用
 
(一) -60~ 0℃ 储存

此温度是水的结晶温度，容易对细胞和组织的微观结构造成损害，一般不使用这一温度来保存组织和细胞。且在组织样本内生物大分子受到细胞组织内多种因素的影响，稳定性有可能明显降低，所以通常样本库不使用 -60~0℃ 作为储存温度。
 


(二)-80℃ 储存

-80℃ 是较常用的样本保存温度，也是常用超低温冰箱所能达到的温度。基于操作简便性、储存量和成本等因素来考量，这一温度也是目前保存样本中生物大分子活性的常用温度。

 
但对不同的生物大分子活性来说，这一温度下到底能保持多久的问题仍然处于研究探索中。

组织中 DNA 的稳定性较好，可以在 -80℃ 下保持数年或更长时间。但 RNA 则容易被广泛分布于细胞和各种组织里的 RNA 酶降解。RNA 在稳定剂中的储存时间一般不超过 5 年。所以为长期保存 RNA 活性，建议使用更低的温度，或者利用小部分样本提取 RNA 与剩余样本同步储存。其他样本内的蛋白质和脂类等生物大分子在 -80℃ 下也能保存，但时间长短不一，稳定性逐渐衰减。
 
另外，目前常见的大型自动化样本存储设备只能和 -80℃ 超低温设备配套使用，尚不能够和液氮设备配套使用。英国的 UK Biobank 则是把一部分样本的拷贝(约 95 万)储存在 -80℃ 做工作样本，使用自动化设备存取；另一部分拷贝(约 550 万) 在另外一个地方储存在气相液氮罐中做安全备份，样本手动存取。

（三）-140℃ 储存

-140℃ 是低于水的玻璃化温度（-136℃），也是气相液氮罐和深冷冰箱所能达到的温度，样本在这一低温范围内生物学活动极大降低，是保存样本中细胞活性的理想温度。



 
深冷冰箱是电制冷，无需液氮，装满样本后的稳定温度通常在 -140℃ 以下，和使用气相液氮罐相比，其优势在于不需频繁添加液氮，维护方便。但电制冷的降温速度低于液氮，一旦开启容器取放样本时容易造成较大范围的温度波动，温度恢复时间也相对较长，因而更适合较少开启取放样本的情况。另外，电制冷冰箱必须保障供电，在断电情况下推荐使用液氮设备以提供备份储存。

（四）-196℃ 储存

-196℃ 是液氮挥发的温度，所以只有液氮液相保存技术能达到此温度。样本内的生理、生化活动在此温度下基本停止，稳定性状的样本可以得到长期保存。液氮保存是长期保存样本内细胞活性、组织器官的复杂结构及活性的最有效方法，已广为接受与认可。



与其他不同温度冷冻模式相比，液氮容器液相储存样本需要做好防护样本间的交叉污染。美国国家癌症研究所推荐螺旋盖并带有橡胶密封圈的冻存管封装样本。但在降温过程中样本从超低温冰箱（-80℃）转移到液氮中时骤然降温，引起冻存管管帽和管身收缩不一致，容易导致液氮渗入冻存管，从而增加样本间交叉污染的风险。解决的办法之一是可以使用专门的冻存管管套对每个冻存管进行热缩密封，或是使用密封膜在冻存管管帽与管身接口处缠 2~3 圈再储存。

1995 年，英国血库曾发生过轰动一时的液氮冻存中破裂的血袋之间乙型肝炎病毒交叉污染事件，这是样本库污染的典型案例。液氮并不能做到真正无菌，它不能消毒，只能降低细菌、病毒的活性，这种潜在的生物危害会使浸泡在液氮中的样本被污染。因此研究者又发明了一种新的液氮方法——气相液氮罐，将样本置于液氮蒸气中。虽然用气相液氮罐存储样本也不是完全没有风险，致病菌、真菌还是有可能生长，但是因为没有液体介质的存在，从而避免了交叉污染。
 
二、常见样本储存温度的选择

选择储存温度应考虑样本的类型、预期储存的时间、样本中生物分子的特性、不同细胞的特性。
 
细菌和细胞的活性临界温度通常认为是 -140℃，在这个温度下，所有的代谢活动都停止，对于能承受在此温度下保存的样本，建议选择低于这个温度进行储存，利于长期稳定的储存。一些样本不能承受这么低的温度，它们的储存温度一般选择 -80℃，在此温度下，代谢活动并没有完全停止。另外，一些经过特殊处理的样本，则可在低温和室温条件下储存。

1）固体组织样本的储存温度：
长期储存的新鲜冰冻组织和 OCT 包埋冰冻组织应储存于液氮中，冰冻组织切片或者用于 DNA 和 RNA 提取的冰冻组织应储存在 -80℃。经过福尔马林固定的石蜡包埋组织及组织切片应储存在室温，在低于 27℃ 的环境下，并控制虫患和湿度。

2）液体样本的储存温度：
对于液体样本，包括血液和尿液，样本里的各种成分应在储存前分离，使得每一种成分能够在最佳条件下储存。全血、血清、血凝块、非淋巴细胞和血浆样本应储存在 -80℃。血沉棕黄层和白细胞应储存在液氮中。尿液应储存在 -80℃ 或者液氮中。

3）细胞的储存温度：
长期保存的细胞系应储存在液氮中。气相液氮比液相液氮储存样本更好。虽然液相液氮的温度更低一些（-196℃），但气相液氮的温度（-150℃）仍在临界温度之下。对于需要但没有条件使用液氮保存的细胞样本，应至少储存 -80℃ 环境中。
 
三、样本的冻存和取用

样本储存在稳定的条件下，应避免反复冻融。样本反复冻融会加快生物大分子物质的降解，严重影响样本的质量。样本在冻存前，最好分装成小份样本再储存，可以避免不必要的反复冻融，一般够一次研究用量即可。
 
当需要冻融样本时，应按照标准流程确保样本的稳定性和质量。样本在冻存过程中应采用合适的冷却速度，控制冰晶大小，以及冰晶形成速度，这些将影响到样本的质量。
 
样本使用时，需要采取必要的融化和复苏。储存的温度越低，复苏和融化所需的时间越长。当从冷冻状态中解冻时，最hao的方式是 37℃ 水浴，过程不宜太长，避免损害样本的生物活性。

本文内容整理自郜恒骏主编
《中国生物样本库——理论与实践》
 
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